本试剂盒可以从少量的生物样品中快速提取高质量的总 RNA, 具有操作  简单快速，性能可靠，不使用酚、氯仿等有毒物质的优点。本产品适用于  细胞、特定类型的动物组织的 RNA  提取，提取得到的总 RNA  可用于  RT-PCR、RT-qPCR、Northern   blotting、cDNA 文库构建等多种实验。 本试剂盒提供的裂解液 (Lysis     Buffer)中含有强变性剂，能够迅速裂解  样品并失活 RNA 酶，确保操作过程中 RNA 的完整性。本试剂盒大致的操  作过程如下：首先用裂解液裂解样品；裂解好的样品加入乙醇混匀即可上  柱，离心去掉液体将RNA 结合在柱子上；杂质在清洗过程中被有效去除； 洗脱 RNA 并用于下游实验。

产品内容

*第一次使用前，须向Wash Buffer 中加入48 ml 无水乙醇。

保存条件

Elution Buffer 需要分装成小份室温保存，其余试剂和 RNA 柱室温保存 (使用中谨防试剂被污染)。(附赠的 DNA 酶收到后需置于-20 ℃保存。)

关于试剂盒的适用性

本产品仅用于科研，请勿用于医药、临床治疗、化妆品及食品等用途

用于细胞样品时建议用6孔板或35 mm  培养皿培养细胞，培养至合适的密度进行 RNA 提取(24孔板培养的细胞培养至90%以上的细胞密度也可使用)。不建议用100 mm  培养皿培养的细胞直接进行 RNA 提取，否则可能导致细胞裂解不充分或因核酸 过量导致离心柱堵塞或导致基因组残留。

用于组织样品时建议用于内脏组织、肿瘤组织等，不适用于皮肤等坚韧的组织。

该试剂盒可提取5~300 万常规细胞或1~100 mg 组织的 RNA ,对于T 细胞/B 细胞 等体积很小、RNA 含量很低的细胞，建议增加细胞数到至少100万以上。

操作步骤

样品裂解

1A. 对≤3×106/孔的贴壁细胞：

实验流程图

a)      吸干培养基，用适量的 PBS 洗     1.样品裂解

一次；                                         含Ly(对)

b)     加入500μl 的 Lysis Buffer ,用     ；          离心取(次加人)上清；(裂解)加入等(液裂解；)体(12)积(00)的(0)无(g)

力吹吸10次，转移至EP管中，                     水乙醇，充分混匀

vortex 10秒钟以充分裂解细胞；

1B. 对>3×106/孔的贴壁细胞或悬浮细                    物加入离心柱中

胞：

a)      (本步适用于贴壁细胞。对于悬

浮细胞，从步骤 b 开始操作)用胰酶                4000g  室温离心1分钟

消化将贴壁细胞悬浮起来；

b)  取含1×106个细胞的悬液至     3.柱清洗            Buffer到(深加500)离(μ)l心(W)柱(as)中(h)

1.5 ml离心管，500 g 离心3分钟

以沉淀细胞；

c)  小心吸干上清，注意不要吸到细

胞，以免细胞丢失；

d)    加入500μl 的 Lysis Buffer ,用     4.洗脱              将离心柱转移至新的EP

力吹吸10次， vortex 10秒钟；                      加(管)入(中)2(，)0～开50(盖)晾μl E(干2)lut(分)ion(钟)；

1C. 对动物组织(适用于内脏组织、肿瘤                     Bulfer 到离心柱中

组织等，不适用于皮肤等坚韧的组

织):                                       室温放置1-2分钟，12000 g 室|

a)    切取1～100 mg 的组织小块至             温离心 心产物(1分钟，)即(弃)为RN(去离)A(心)柱，离

称过重的1.5 ml 离心管，称量

得到组织重量。加入300μl 的Lysis   Buffer;

b)  用研磨棒或匀浆机匀浆。当组织块重量大于5mg  时，从匀浆液中取出一部 分，其中含有5 mg 的组织；

c)  向取出的匀浆液中加入Lysis Buffer,补足到300μl。再次研磨之后漩涡震 荡10秒钟，以充分裂解组织；

d)    12,000×g 离心2分钟，将上清转移到新的1.5 ml 离心管中；

上柱/RNA 结合

2.  向裂解的细胞或组织中加入等体积的无水乙醇充分混匀(可能会产生沉淀，这 是正常现象，继续进行操作即可)。可将离心管颠倒几次，或用移液器用力吹 吸10次使可能产生的沉淀分散开，然后将液体加入离心柱。

3.   4,000×g 离心1分钟(对于细胞数大于1.5×106的细胞样品或组织样品，建  议12,000×g 离心)。可选操作：若实验对基因组的少量残留极其敏感，可用试 剂盒附赠的 DNA 酶处理，具体处理方法详见最后一页：【常见问题及解决方案】 第5条。

柱清洗

4.  向 RNA 柱中加入500μl的 Wash   Buffer,12,000×g离心1分钟(离心结束 后取出柱子时注意不要让收集管内的废液接触到 RNA 柱，以免污染。可以倒掉 废液，将 RNA  柱装回收集管，空管离心一次，能完全去除可能残留的 Wash

Buffer。若按标准步骤提取的 RNA纯度不够时可采用此方法优化)。 5.  将柱子放到干净的无 RNA 酶的1.5 ml 离心管上，开盖晾干2分钟。

RNA 洗脱

6.  在 RNA 柱的膜中心部位加入20～50μl的 Elution Buffer,室温静置2分钟。

7.  12,000×g 离心1分钟(洗脱下来的 RNA 溶液重新加入柱中，静置5分钟，再 次离心可提高洗脱效率，得到更多RNA)。(RNA  洗脱下来后，建议置于冰上。)

8.  测定洗脱的 RNA  浓度，以便于后续实验使用。提取出来的 RNA 可立即用于后 续实验，也可保存在-80 ℃备用。

关于 RNA 浓度与纯度：本试剂盒提取的 RNA, 使用 Nanodrop 等微量分光光度计测 定OD  260/280在1.90~2.2之间均属正常(因不同仪器之间存在误差，若OD 比值 略有超出，但上下不超过0.1,且吸光度曲线正常，则亦可接受)。经检测，对于少量

细胞或组织样品，使用本试剂盒提取的 RNA

实验结果示例

浓度最低不低于30ng/μl 即可使用。

图1.本试剂盒与TRIzol 法从不同数量的293T 细胞中提取的 RNA 电泳对比(50 μl 洗脱，上样量5μl)。M:250bp   DNA   Ladder;泳道1、2:本产品提取3×105 和6×105细胞；泳道3、4:TRIzol提取3×105和6×105细胞。可见，本试剂盒 提取 RNA 的产量高于TRIzol法。图2.本试剂盒提取的 RNA 用 Nanodrop 测得的