碧云天生产的蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法)，即Protein Cysteine Assay Kit with DTNB，也称蛋白质半胱氨酸含量检测试剂盒，是一种高效、便捷的用于细胞培养上清液、血清、血浆、细胞及组织裂解液样品中暴露的或表面的游离巯基(Exposed/Surface free sulfhydryl groups)和埋藏于蛋白内部的游离巯基(Buried free sulfhydryl groups)以及蛋白质中的二硫键(-S-S-, Disulfide bonds)被还原后的巯基检测试剂盒。本试剂盒采用显色法(吸光度法)进行检测。

巯基(Sulfhydryl groups or Thiols)，又称氢硫基或硫醇基，化学式为-SH。巯基是生物系统中反应性非常强并且广泛存在的基团之一，它存在于大多数蛋白质中，也存在于一些低分子量物质中，如谷胱甘肽(GSH)、CoA、脂酸、DTT、巯基乙酸盐和游离半胱氨酸等[1]。蛋白质中的巯基通常可分为暴露的游离巯基(Exposed/Surface free sulfhydryl groups)和在蛋白质高级结构中的游离巯基(Buried free sulfhydryl groups)，两者之和为总游离巯基(Total free sulfhydryls or unbound thiols)[2]。通常，蛋白质中的游离巯基指的是暴露的游离巯基，即活性巯基，主要存在于半胱氨酸中，是蛋白质结构和生物体内某些氧化还原反应的重要基团，在蛋白质中两个巯基脱氢而形成的二硫键(-S-S-, Disulfide bonds)，使相邻多肽得以连接。本试剂盒使用变性剂将样品中的蛋白进行变性，暴露二硫键和巯基，然后利用还原剂将所有二硫键进行还原，最后检测样品经变性和还原后的巯基含量，作为半胱氨酸的含量。

生物体内的巯基主要为谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基，其中谷胱甘肽巯基主要参与修复氧化损伤的蛋白质和活性氧的清除[3]；蛋白质巯基则主要通过形成二硫键发挥维持蛋白质构象的作用[4]，而蛋白质中检测到增多的游离巯基则提示二硫键发生断裂，蛋白质结构发生变化。目前，巯基传统的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-GC)等[5]。虽然这些方法在游离巯基检测的灵敏度和准确度上有一定优势，但是样品处理和实验操作相对复杂、对仪器的要求较高、检测耗时较长、且无法同时检测多个样品。

本试剂盒采用经典的基于DTNB的游离巯基定量检测方法。5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB)，又称为6,6′-二硝基-3,3′-二硫代苯甲酸、Ellman试剂(Ellman Reagent)、二硫代硝基苯甲酸或双(3-羧基-4-硝基苯基)二硫，是一种与巯基相互作用的水溶性试剂，可用于组织、蛋白质和多肽中巯基含量测定，基本反应原理如下：样品中的蛋白质通过变性处理，原有构像发生改变，蛋白质肽链松散开，二硫键或者巯基暴露，还原剂将二硫键还原成巯基(-SH)，巯基(R-SH)与DTNB反应生成黄色可检测的2-硝基-5-硫代苯甲酸盐阴离子(TNB)和混合二硫化物(R-S-TNB)，TNB在412nm处有强吸收峰，测定此处的吸光度，并以谷胱甘肽为标准品，可计算出样品中半胱氨酸的含量[6]。本试剂盒不仅可检测暴露的或表面的游离巯基，还可以检测蛋白质高级结构中的游离巯基，以及蛋白质中二硫键还原后产生的游离巯基，如需检测总游离巯基，可使用总巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0141)，两者配合使用即可计算出蛋白质中二硫键的含量；如需检测游离巯基，可使用游离巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0138)，配合总巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0141)即可计算出蛋白质高级结构中的游离巯基含量；如需检测谷胱甘肽，可使用总谷胱甘肽检测试剂盒(S0052)、GSH和GSSG检测试剂盒(S0053)。碧云天三种巯基检测试剂盒的比较可以参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/thiol-assay.htm。

图1.碧云天蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法) (S0145)工作原理图。

本试剂盒样品处理简单，检测速度快。对于细胞培养上清液、血清、血浆可直接检测；对于细胞及组织样品只需匀浆裂解，取上清进行检测。整个检测过程不足4个小时即可完成。

本试剂盒的Assay Buffer经过优化，可螯合可以氧化巯基的二价金属离子，防止样品被氧化导致样品中巯基含量低于实际值。

本试剂盒提供了检测所需的DTNB和Assay Buffer，同时还提供GSH作为标准品或阳性对照(Positive control)。本试剂盒检测GSH标准曲线的效果如图2所示。最低检测限约为10μM。

图2.碧云天蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法) (S0145)用于GSH标准曲线的检测效果图。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装的可以进行100-200次检测，中包装可以进行500-1000次检测。

-20ºC保存，两年有效。4ºC保存，3个月有效。GSH和DTNB在配制成溶液后，需适当分装，-20ºC保存至少3个月有效。Protein Precipitation Solution须避光保存。

本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品中的还原剂例如DTT、巯基乙醇等，无法避免，则应尽量控制还原剂的总浓度低于待测样品中的巯基浓度。常用的Triton X-100、Tween-20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，如果必须使用去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。

Reduction Buffer对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。建议在通风橱内操作。Protein Precipitation Solution有腐蚀性，操作时请小心，并确保有效防护以避免直接接触人体，并须注意避免腐蚀其它物品。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。