Cell Counting Kit-8，简称CCK-8（或CCK8）试剂盒，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8化合物被活细胞内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm处有最大吸收峰。甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。本试剂盒中WST-8对细胞无明显毒性，可以用于外源细胞因子等诱导的细胞增殖检测，以及药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测，是MTT检测方法的升级版。

      本试剂盒使用便捷，无需配制或稀释，无需收集或洗涤细胞，无需对甲臜化合物进行再次溶解，对贴壁细胞及悬浮细胞均适用。且酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

储存与运输

      冰袋（wet ice）运输；2-8℃保存12个月有效；长期不用也可-20℃保存，24个月有效；长期保存建议避光保存。

操作步骤

1. 制作标准曲线（测定细胞具体数量时进行次操作）

      A) 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

      B) 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。

      C) 接种后培养至细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD 值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间）。

2. 细胞活性检测

      A) 在 96孔板中接种细胞悬液（100 µL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在 37℃，5% CO2 的条件下）。

      B) 向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。

      C) 将培养板在培养箱内孵育 2小时。

      D) 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

      E) 如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 h内吸光度不会发生变化。

3. 细胞增殖-毒性检测

      A) 在 96 孔板中配置 100 µL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 小时（在 37 ℃，5% CO₂ 的条件下）。

      B) 向培养板加入 10 µL 不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 小时）。

      C) 向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

      D) 将培养板在培养箱内孵育 2小时。

      E) 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

      F) 如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 µL 0.1M 的 HCl 或者 1% SDS (W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

4. 活力计算：

      细胞活力（％）=[A(加药)－A(空白)]／[ A(0 加药)－A(空白)]×100

      A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

      A（空白）：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

      A（0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

      细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项

      1. 本试剂盒检测原理是依赖于脱氢酶催化的反应，样品中如有较多还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，需设法去除。

      2. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

      3. 白细胞可能需要培养较长时间。

      4. 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1 ,000 个/孔 (100 µL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 µL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

      5. 如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 检测灵敏度最高。

      6. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

      7. 加检测试剂时避免产生气泡，否则会干扰检测结果。

      8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。