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BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料)
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  • 货号 D7601S
  • 品牌 Beyotime/碧云天 ( 生产厂家 )
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碧云天的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料),即BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix with Tracking Dyes,是一种用于实时荧光定量PCR,即qPCR (Quantitative PCR)或Real-time PCR,含双染料示踪系统(with a dual-dye tracking system)的高品质预混液,可利用两种示踪染料混合后产生的变色效应追踪移液过程,方便用户分辨空白孔和加入qPCR Mix的孔,并确认体积较少的DNA样品是否已经添加到qPCR Mix中,可快速便捷的用于cDNA或基因组DNA等的特异性超高灵敏度定量检测。

在进行qPCR反应体系的溶液配制时,由于DNA样品加入的体积通常只有1-2微升左右,很难通过肉眼分辨是否已经加入了样品。本产品中的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)中添加有示踪作用的惰性蓝色染料,同时提供具有惰性黄色染料的模板稀释液Template Dilution Buffer (40X, Yellow),在配制qPCR反应体系时,随着两个组分的混合,溶液颜色会产生显著变化,即当黄色溶液加入到蓝色溶液中后,变成绿色溶液,从而可以根据液体颜色变化准确判断是否已加入DNA模板和qPCR mix,这就在加样过程中起到示踪作用,提高qPCR体系设置的正确率,避免漏加或错加模板等[1]。

本产品中的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)使用SYBR Green I作为荧光染料,经反复验证,添加的蓝色和黄色两种惰性示踪染料的光谱与SYBR Green I不重叠,不会影响荧光定量检测,也不影响扩增体系的酶活性(图1)。SYBR Green I是一种结合于双链DNA (Double-strand DNA, dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱,一旦与双链DNA结合后,其荧光会大大增强。通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

图1. 碧云天BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料) (D7601)与BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX) (D7262)的扩增效果对比图。如图A-C所示,将初始浓度为10ng/µl的标准品质粒进行6个10倍梯度稀释,分别使用添加双重示踪染料的本产品(With tracking dyes)和未添加示踪染料的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX) (D7262) (Without tracking dyes)进行扩增检测。图A、图B分别为本产品和D7262的扩增曲线图;图C为根据图A和图B扩增曲线的CT值绘制的标准曲线,横坐标为稀释后的样品经计算后的拷贝数的对数(Log10),纵坐标为对应的CT值;图D为分别使用添加双染料示踪指示剂的本产品和D7262对30个基因进行扩增,横、纵坐标分别为D7262和本产品扩增不同基因的CT值,结果显示两个产品使用效果基本一致。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品中的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)中使用的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶,能够实现便捷高效的热启动。BeyoFast™ Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合,从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性,这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活,这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来,预变性之前不会发生DNA聚合反应,从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性[2,3]。

本产品中的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、蓝色示踪染料、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分,使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品DNA和去离子水即可。

本产品提供了Low ROX和High ROX,广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动,从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起,如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同,请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。通常含高浓度ROX的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料)也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

添加ROX类型 适用PCR仪
不需添加 Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000;
Roche: LightCycler 480; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR
Low ROX ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6 and 7 Flex Systems;
Stratagene: Mx3000P, Mx3005P and Mx4000;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000;
Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon 2 and Opticon;
High ROX ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000, 7700; ABI 7300, 7900HT(Fast); ABI StepOne(Plus)

本产品稳定性好,在37ºC条件下保存3天不影响产品扩增效果(图2)。

图2. 碧云天BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料) (D7601)的稳定性检测效果图。将37ºC保存3天与-20ºC正常保存的本产品用于相同模板的扩增对比分析,结果显示以上两种储存条件下qPCR产物CT值基本无差异。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

相对于同类产品(Competitor),本产品颜色差异更显著、扩增性能更灵敏(图3)。

图3. 碧云天BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料)系列产品与国内同类产品(Competitor)的颜色差异与检测效果对比图。图A为本产品与同类产品稀释至1X时的外观颜色对比分析,第一列与第四列的蓝色孔(1X Blue)为稀释至1X的含蓝色示踪染料的SYBR Green qPCR Mix,第二列与第五列的黄色孔(1X Yellow)为稀释至1X的含黄色示踪染料的Template Dilution Buffer,第三列与第六列的绿色孔(Mixer)为稀释至1X的含蓝色示踪染料的SYBR Green qPCR Mix与含黄色示踪染料的DNA模板的混合物。经对比,本产品的颜色差异更显著,示踪效果更明显。图B为本产品与同类产品对标准品质粒的qPCR检测扩增曲线对比分析,相对于同类产品,本产品扩增的CT值略低,检测效果略更灵敏。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl),小包装可以进行100次检测,中包装可以进行500次检测,大包装可以进行2500次检测;如果用于常规的384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl),小包装可以进行200次检测,中包装可以进行1000次检测,大包装可以进行5000次检测。

保存条件:

-20ºC避光保存,一年有效;4ºC避光保存,一个月内有效。尽量避免反复冻融。

注意事项:

使用前需确保本产品完全融化,上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

注意引物退火温度,当退火温度<60ºC时,推荐使用三步法PCR扩增。

BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)中含有SYBR Green I荧光染料,保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射,以尽量避免荧光淬灭问题。

对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段,建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。

经测试,本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品,反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测,PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃,以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。若反应体系存在扩增产物污染,推荐使用防污染型qPCR Mix。

建议进行熔解曲线(Melt curve)分析以确定扩增反应的特异性。如果只有一个熔解曲线峰(对应的退火温度即双链DNA产物的Tm值),说明只有一种单一产物;如果熔解曲线出现双峰、多峰或杂峰峰,可能是引物二聚体或非特异性扩增、存在基因组DNA污染、试剂及环境被污染等。建议设置不含模板的对照(No template control, NTC),即反应体系中包含除模板以外的所有反应组分,根据样品孔和无模板对照孔熔解曲线的差异,可判断是否存在引物二聚体或其它的非特异性扩增。

超纯水推荐选购碧云天生产的BeyoPure™ Ultrapure Water (PCR级, Sterile) (ST873)。

qPCR的内参引物和目的基因引物推荐选购碧云天预先设计、经过qPCR验证、预混的引物对产品。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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