基因型 F' proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS -mcrBC) 产品说明 Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性，Stable感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。 操作方法 1. Stable感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，6分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。 2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置5分钟，晃动会降低转化效率。 3. 向离心管中加入0.9 mL室温S.O.C.或LB培养基(S.O.C.营养丰富，可提高转化效率)。 4. 30℃，250 rpm复苏60分钟。 当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃，225 rpm复苏60分钟 5. 筛选平板提前拿出放30℃孵育使平板温度保持30℃，吸取50-100 μl直接涂筛选平板或5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的S.O.C.或LB培养基上。 6. 将平板倒置放于30℃培养20-24小时或37℃过夜培养。 当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃培养过夜 注意事项 1. 对不稳定DNA片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建，涂板后平板应在30℃培养，以减少发生错误重组的概率。 2. 制备高纯度病毒质粒时，应使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后使用。 3. 对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免将质粒保存在大肠杆菌细胞中。 4. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中10分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作。转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 5. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2倍） Stable菌株使用常见问题 1. 在使用Stable感受态时怎样提高病毒质粒的产量？ 答：为了提高Stable菌株中的病毒质粒产量，可采用以下方法： A，接菌时用新鲜的菌斑，不要使用4℃保存的菌落接菌，摇菌时用大体积容器，225 rpm，增加溶氧量。 例如：小提质粒时，50 ml离心管中接入6 ml LB菌液，羧苄青霉素50 µg/ml，接新鲜克隆，37℃，225rpm  摇菌20小时；大提质粒时，2L离心瓶中接入200ml LB菌液，羧苄青霉素50 µg/ml，接新鲜克隆，37℃，225 rpm摇菌20小时。 B，对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免将质粒保存在大肠杆菌细胞中。对摇好的菌液应立即提取质粒，不可将菌液在室温或低温放置一段时间后提取质粒。 2. 可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable扩繁病毒质粒吗？ 答：可以代替，Stbl3菌株和Stable菌株在病毒构建和扩繁过程中具有很低的错误重组概率，我们推荐在试验中优先使用。普通大肠杆菌如TOP10或DH5α也可以扩繁病毒质粒，只是产量要低一些，并且在扩繁过程中容易产生错误重组，导致一些必要元件的删除，当使用TOP10或DH5α时，最好在30℃摇菌，采用低盐浓度的LB溶液（5 g/L 氯化钠）以降低错误重组的概率。 3. 在使用Stable或TOP10感受态细胞构建或扩繁病毒质粒时，经常会看到在平板上长出偏小或偏大的克隆，我应该选择哪种克隆进行后续实验？ 答：我们推荐挑选直径偏小的克隆进行后续实验，Stable和TOP10菌株在构建或扩繁病毒质粒过程中都有可能产生末端重复区的错误重组，发生错误重组的病毒质粒赋予该克隆生长速度加快的优势，因而产生直径偏大的克隆。 4. Stable生长速度很慢，在37度15小时后菌落很小，这种情况正常吗？ 答：这是正常结果，与DH5a或TOP10这种常用克隆菌株相比，Stable生长速度确实很慢（37度的倍增时间是30-35min，而DH5a或TOP10的倍增时间为25min左右），所以平板在37度生长时需要15-20h，在30度生长需要24h以上。但是平板在37或30度放置时间过长会产生假阳性，应免假阳性的产生。 5. Stable摇菌很长时间菌液依然很淡，这种情况怎么解决？ 答：有两个原因：1，Stable菌株生长速度慢；2，Stable菌株对融氧要求较高，应增大液面面积与液面高度的比值，这样才能在摇菌时使液面产生起伏波动，增加融氧，加快菌株的生长。