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基因型
F–ara–14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm–6 hisG4 rfbD1 rpsL136 dam13::Tn9 xylA5 mtl–1 thi-1 mcrB1 hsdR2
产品说明
GM2163菌株具有氯霉素抗性和硫酸链霉素抗性,是甲基转移酶dam、dcm缺失的 K12 菌株,提取得到的质粒DNA可被对dam、dcm甲基化敏感的内切酶切割;甲基转移酶dam、dcm突变导致细胞内基因突变率增加,菌落生长时会产生大小两种菌落,挑菌时尽量挑中等大小或偏小的菌落。无lacIqlacZΔM15,不可进行蓝白斑筛选。GM2163感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19 质粒检测转化效率>3×108 cfu/μg DNA。
操作方法
1. GM2163感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心1分钟收集菌体,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作,转化高浓度质粒或连接产物可相应减少用于涂板的菌量。
2. GM2163感受态转化效率较高,对 DNA甲基化有特殊要求的试验可用GM2163代替JM110使用。
3. 若要获得大量,高纯度质粒,建议在TB培养基(唯地CAT#:CM1018L)中摇菌培养(以标准质粒PUC19为例:在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍,SOC的2倍)