基因型 F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA 产品说明 BL21(AI)是大肠杆菌B/r型菌株(E.coli B/r)，来源于BL21菌株，为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解。在培养基中添加L-阿拉伯糖可诱导araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而促进目的蛋白的表达。在培养基中添加葡萄糖可抑制araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而抑制目的蛋白的表达。BL21(AI) 感受态细胞适用于任何以T7启动子为基础的表达载体，能够进行高水平的重组蛋白表达。因为菌株能够对体内的T7 RNA聚合酶水平进行高效调节，BL21(AI) 感受态细胞能够表达对其他BL21细胞有毒性或抑制生长的蛋白。普通重组蛋白在BL21(AI) 菌株中获得产量和其他BL21菌株产量相当；对大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中获得的产量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。BL21(AI) 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108 cfu/μg DNA。 操作方法 1. BL21(AI)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。 2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。 4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。 5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。 注意： 1. Brian Caliendo (Voigt 实验室)报道过pCP20质粒比较难于转化到这个感受态细胞中，而pCP20转化到其他菌株中都很正常，但是具体原因未知。 2. 不加葡萄糖，BL21(AI) 细胞的araBAD启动子下游的本底蛋白表达水平仍然很低，加入葡萄糖后能够进一步的降低本底蛋白的表达水平。 蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only) 1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落， 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。 2. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。 3. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。     4. 第三步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），加入过滤除菌的L-阿拉伯糖（唯地CAT#：C1040）至终浓度为0.2%，继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。 L-阿拉伯糖的浓度决定T7RNA聚合酶的丰度，L-阿拉伯糖的浓度越高，细胞内T7RNA聚合酶越多，目标蛋白mRNA的转录越快，蛋白的翻译也越快，有利于目标蛋白产量的提高，但同时会增加形成包涵体的概率。若目标蛋白合成正常但在包涵体中比例过高，可溶蛋白比例偏低，可以考虑降低营养液中L-阿拉伯糖的浓度，L-阿拉伯糖浓度的可调节范围为0.05%-0.5%；若目标蛋白无法诱导或诱导条带偏弱，可以考虑提高诱导时营养液中L-阿拉伯糖的浓度，诱导不同蛋白的最佳阿拉伯糖浓度需要实验者优化。实验者也可在调高L-阿拉伯糖浓度的同时提高IPTG浓度；在调低L-阿拉伯糖浓度的同时降低IPTG浓度（IPTG浓度的可调节范围为0.1-20mM）。 5. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。 6. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。 7. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。 1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）： 2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。 注意事项 1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 2. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可），若蛋白表达载体使用T7启动子诱导表达，需要在培养基中同时加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖。为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。 建议选择该菌株进行蛋白表达的条件如下： 1.使用T7启动子载体（高拷贝或者低拷贝都可以）进行蛋白表达。 2.使用其他BL21菌株进行蛋白表达时，观察到明显的细菌生长的抑制作用。 3.表达一个已知的毒性蛋白。