基因型 F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm(DE3) pRARE(argU, argW, ilex, glyT, leuW, proL) (CamR) 产品说明 Rosetta(DE3)菌株具有氯霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108 cfu/μg DNA。 操作方法 1. Rosetta(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。 2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。 4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。 5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。 蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only) 1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB（唯地CAT#：CM1018L）、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。以质粒pet32a为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度约为LB的3-5倍，SOB的2-3倍。 2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。 3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。 4. 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。 5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。   6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。 7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。 8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。 9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。 1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）： 2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。 氯霉素配制（唯地CAT#：YC9030）： 氯霉素(Chloramphenicol) 100mg/ml溶于乙醇，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌；工作浓度：34 µg/ml。 注意事项 1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可）。 4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。 5. Rosetta(DE3)菌株携带pRARE质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失。 6. 具有氯霉素抗性，不能用于具有氯霉素抗性质粒的表达。