基因型 E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ TetR gal λ(DE3) endA Hte [cpn10cpn60 GentR] 产品说明 ArcticExpress (DE3)来源于E. coli B，为Lon和OmpT蛋白酶缺陷型菌株，可促进表达蛋白的稳定。ArcticExpress (DE3)菌株染色体DNA中整合了λ噬菌体DE3区，使得ArcticExpress (DE3)菌株可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，广泛用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。ArcticExpress (DE3)菌株具有四环素，庆大霉素抗性，endA1突变有利于质粒DNA的稳定。[cpn10cpn60 GentR]的存在使ArcticExpress (DE3)可以表达适应低温的伴侣蛋白Cpn10和Cpn60（来自嗜冷菌—Oleispira antarctica）。Cpn10和Cpn60伴侣蛋白在4-12℃表现出较高活性，在ArcticExpress(DE3)细胞中表达时，可降低重组蛋白包涵体的形成，增加可溶重组蛋白的表达量及生物活性，比传统的原核表达伴侣蛋白GroEL、GroES等具有更加优异的促融性能。唯地生物生产的ArcticExpress (DE3)感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108cfu/μg DNA。 操作方法 1. ArcticExpress (DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。 2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。 4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上（（平板中务必同时含有20ug/ml的庆大霉素和转化质粒本身的筛选抗生素；若质粒浓度较高，也可稀释后涂板，务必保证能在平板上挑到单克隆菌落）。 5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。 蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only) 1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。 2. 37℃，220-250 rpm过夜摇菌约10-15h。 3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。 4. 30℃，220-250 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2.5-4h）。 5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。   6. 测OD值之前预先准备一低温摇床，温度设置10-13℃，将第四步的三角瓶放入低温摇床220-250摇菌10分钟，温度降至10-13度后加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续摇菌24h。 7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第16h，20h，22h，24h，28h取样，离心后放-20℃保存）。 8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。 9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。 1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）： 2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。 注意事项 1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 2. ArcticExpress (DE3)菌株携带pACYC质粒。除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有20ug/ml的庆大霉素，以防质粒丢失。 3. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。 4. ArcticExpress (DE3)感受态细胞具有四环素、庆大霉素抗性，不可用于具有四环素、庆大霉素抗性质粒的转化。