基因型 E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-)galλ(DE3) [pTK TetR] 产品说明 TKB1是BL21(DE3)菌株的衍生菌株，广泛用于蛋白的原核表达实验，该菌株表达的蛋白可以在潜在的酪氨酸位点完成磷酸化，提高原核表达蛋白的可溶性和有功能蛋白的大量纯化。将酪氨酸激酶Tyrosine Kinase(TK)基因连入可诱导的启动子构建质粒，并将该质粒命名为pTK；pTK质粒转入BL21(DE3)菌株，命名为TKB1菌株。TKB1为Lon和OmpT蛋白酶缺陷型菌株，可促进表达蛋白的稳定；同时该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，整合于大肠杆菌的染色体上)，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。TKB1感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×107 cfu/μg DNA。 操作方法 1. TKB1感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。 2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。 4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素（培养基中除了加转化质粒的筛选抗生素，还要加入四环素：终浓度10ug/ml）的2YT或LB培养基上。 5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。 磷酸化蛋白的两步诱导(仅供参考) 一. 目的蛋白的IPTG诱导表达 1. 新鲜的平板，挑选独立的菌落接菌到LB+筛选抗生素+四环素(10ug/ml) 液体培养基2ml（用>10ml的圆底试管或蓝盖管）中，37℃，200 rpm 摇菌10-15h。 2. 第一步的小摇菌液按1%的比例接菌到适量LB+筛选抗生素+四环素(10ug/ml) 液体培养基中，37℃，150-200 rpm 摇菌到OD 600为0.6-0.8之间时停止。 3. 加入适量IPTG，IPTG终浓度在0.4-5mM之间即可，在适当的温度，200 rpm摇菌。为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。 二. 酪氨酸激酶的诱导表达和目的蛋白的磷酸化 4. 2000×g离心收集第三步菌体，重悬在TK诱导培养基+筛选抗生素+四环素(10ug/ml)中，调整菌体浓度在OD 600为0.5，37℃，200 rpm 摇菌2h。 5. 2000×g离心收集菌体，可做后续的SDS-PAGE，染色，Western Blot分析，也可放-20度长期保存。      注意事项 1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，长时间存放会降低转化效率。 2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。 4. TKB1菌株具有四环素抗性，不可用于具有四环素抗性质粒的转化，携带  pTK质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有 10 µg/ml 四环素，以防质粒丢失。