稳定细胞株构建是指将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
       稳定细胞株的构建周期长、难度大，每一步都很关键，尤其是细胞转染，常用物理方法（电转）、化学方法（脂质体等）、生物方法（病毒），根据不同的实验条件，选择最好的方法，来达到实验目的。

基因敲除流程：

       一般选择1-10kb片段大小做敲除，这个大小的效率比较合适；一般选择能够非三倍数的外显子做敲除更好，如果没有问题也不大，可以选择大的片段做就可以了；然后就可以设计并合成Dual-gRNA，通过PCR的方式将目的gRNA构建入敲除载体中，经过测序后就可以用于后续的实验；

   一般构建敲除细胞株可以使用电转或者病毒或者脂质体的转染方式；

电转后经过3天的药物筛选，然后就可以做单克隆了：

A、极限稀释法：其实很简单的啊，就是把你要分离单克隆的细胞收集之后做梯度稀释，稀释到一定的倍数之后，培养，扩出来的就是单克隆了。【这种方法工作量极大，而且克隆很多都是混杂的状态】

B、克隆环法：克隆环是筛选单克隆细胞的一个简单易行的方法，用克隆环可以有效地从培养板或者培养皿等培养耗材获得单克隆细胞。【这种方法极其低效】

3、PCR鉴定与扩增：（1周）

将ClonePlus™技术获得的单克隆在96孔中传代，并将细胞进行PCR鉴定，由于使用大片段敲除，可以直接进行PCR鉴定，无需复杂的测序和读图鉴定过程；所以一般2天完成鉴定过程，然后就可以将目的克隆细胞直径进行直接扩增，交付下游做RT-PCR检测，保证其mRNA的完全被敲除。

实验周期为4~6个月。

其他实验项目：

         分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除/敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SIRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP!
详情见官网：http://www.feifanjcrz.com/?m=home&c=View&a=index&aid=489